自DNA雙螺旋結構解析開始，人們在探究健康與疾病基因組復雜性與差異性上付出巨大努力，測序通量限制和高昂成本成為人們深入分析基因組的首要障礙，2005年推出高通量測序技術初步解決了這個問題，人類基因組測序成本迅速下降，由此產生一個新名詞：下一代測序(next-generation sequencing， NGS)。在過去十多年，NGS不斷進化，人類基因組測序成本已經(jīng)下降至1 000美元/人。
一、NGS技術平臺、發(fā)展趨勢及臨床應用現(xiàn)狀
國內臨床應用短讀長NGS技術主要基于邊合成邊測序(sequencing-by-synthesis， SBS)的Life平臺和Illumina平臺。Life Ion-Torrent平臺采用單核糖核酸增加(single-nucleotide addition， SNA)方法，Illumina平臺依賴于循環(huán)可逆終止(cyclic reversible termination， CRT)技術。盡管短讀長NGS平臺總體準確率較高(>98%)，但讀取高AT或高GC片段錯誤率仍差強人意。由于基因組包含重復序列、結構變異及拷貝數(shù)變化，短讀長測序平臺解析這些信息存在固有缺陷，近幾年相繼推出基于單分子測序和合成法測序第三代測序。PacBio Biosciences單分子實時測序，其PacBio RS Ⅱ平均測序讀長10 000～15 000 bp。2014年，另一種基于納米單分子測序技術原型機-MinION誕生，平均測序讀長>10 000 bp。合成法長讀長測序平臺發(fā)展有2個系統(tǒng)：Illumina長片段合成系統(tǒng)與10×Genomics乳液系統(tǒng)。第三代長讀長測序平臺單個堿基錯誤率較高。
NGS技術廣泛應用于常規(guī)臨床實踐，應用領域包括無創(chuàng)產前檢測(noninvasive prenatal test，NIPT)和胚胎植入前遺傳學診斷/篩查(preimplantation genetic diagnosis/preimplantation genetic screening，PGD/PGS)、遺傳病、腫瘤、藥物基因組等。2014年6月，國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準首個NGS診斷產品用于胎兒染色體非整倍體檢測。NIPT是國內NGS應用最為成熟的領域。NGS應用于PGD/PGS優(yōu)點在于能夠利用單一平臺實現(xiàn)單基因病和染色體異常分析。2014年9月我國誕生世界首例應用多重退火成環(huán)循環(huán)擴增技術進行胚胎全基因組擴增NGS測序試管嬰兒。隨著檢測費用降低和基因解讀能力提高，NGS應用遺傳病特別是罕見病，已經(jīng)由基因組合向全外顯子測序(whole exome sequencing，WES)和全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)轉變。2010年，應用WES技術僅通過4個病例WES即發(fā)現(xiàn)米勒綜合征致病基因DHODH。2016年一項前瞻性研究評估證實單病例WES作為一線分子檢測技術用于新生兒單基因疾病診療臨床效用性。2016年另一項涉及54個國家1 000個家庭研究表明，WGS對未確診疾病診斷率比經(jīng)典遺傳診斷方法還高。
目前腫瘤NGS檢測主要應用于遺傳性腫瘤綜合征篩查和體細胞突變分析。NGS使腫瘤防治措施前移至預防階段。大量研究證實某些遺傳性腫瘤與關鍵基因突變相關，2017版美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡指南指出可利用NGS檢測相關基因突變并行遺傳咨詢。如與遺傳性乳腺癌和卵巢癌、林奇綜合征和神經(jīng)纖維瘤等相關高外顯率基因突變等，此外還有一些中等外顯率和低外顯率基因。NGS在體細胞突變分析領域應用最為廣泛，通過NGS分析腫瘤起始、發(fā)展和轉移階段遺傳變異及相關驅動突變和伴隨突變，有助于腫瘤患者分類、預后、靶向治療、耐藥性分析。國際上相繼成立多個測序計劃致力于破譯癌癥細胞突變模式。癌癥基因組計劃已經(jīng)發(fā)掘近500萬個腫瘤體細胞基因突變，并建立了全世界最大、最廣泛的癌癥體細胞突變數(shù)據(jù)庫。這些大量前期工作為后續(xù)NGS臨床應用打下堅實基礎。如今臨床利用腫瘤熱點突變基因組合，可在1 d內對幾百個腫瘤相關基因幾千個熱點突變位點進行快速檢測。
腫瘤液體活檢和單細胞測序是NGS應用新方向。腫瘤患者外周血含有循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)或者游離腫瘤DNA(circulating tumour DNA，ctDNA)。CTC和ctDNA取材便利，適用于腫瘤個體化診斷、預后、復發(fā)風險評估。2014年一項非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者血漿ctDNA NGS檢測發(fā)現(xiàn)，對Ⅱ～Ⅳ期NSCLC檢測敏感性100%。由于常規(guī)測序樣品來源均是多細胞混合DNA，得到的序列信息是一群細胞基因信息平均值，或其中占優(yōu)勢數(shù)量細胞DNA信息，而單個細胞特性被忽視。單細胞NGS測序能夠揭示細胞個體間差異，可為腫瘤分子分型和個體化治療提供精細化指導，有助于準確理解腫瘤內部異質性和腫瘤演進。
越來越多證據(jù)表明，在相關藥物代謝通路，編碼藥物代謝酶或相關蛋白基因遺傳變異決定個體藥物反應或藥物敏感性。不同患者對同一藥物毒性和療效有不同反應。臨床藥物基因組學發(fā)展日新月異。截至目前，美國食品藥品管理局公布了140余種藥物，建議通過遺傳信息指導其合理使用，美國臨床遺傳藥理學應用委員會發(fā)布了35個藥物臨床藥物基因組學應用指南。目前個體化用藥主要針對某種藥品開展一個或少數(shù)幾個基因分型篩查。例如某些針對表皮生長因子受體靶向藥基因突變檢測、鉑類藥物相關敏感性基因檢測和細胞色素P450家族基因如CYP2D6分型檢測等。影響藥物代謝或敏感性基因很多，應用NGS技術可以得到單個患者成百上千個基因分型結果，全面指導其用藥。
二、NGS技術臨床應用質控問題的現(xiàn)狀和解決辦法初探
NGS檢測比常規(guī)分子檢測復雜，實驗操作部分和生物信息分析部分包括眾多實驗處理和分析程序。從樣本制備到數(shù)據(jù)分析，NGS過程每一步都可能混入錯誤。因此凸顯臨床檢測質控重要性。2015年，國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心NGS檢測體細胞突變有效性室間質評結果分析表明，64家參評實驗室僅33家檢測性能達到標準，只有17家實驗室能正確識別基因組合所有突變，充分反映NGS檢測過程復雜性和制定統(tǒng)一檢測規(guī)范迫切性[12]。目前NGS缺乏統(tǒng)一行業(yè)規(guī)范和檢測標準，導致不同實驗室不同平臺檢測結果無法比較。需要對NGS實驗操作部分和生信分析部分建立執(zhí)行標準和質控監(jiān)測事項。包括建立標準操作流程、驗證流程、質量管理體系、數(shù)據(jù)可靠性驗證等。生物信息分析部分應包括：變異結果描述、附帶結果報道、數(shù)據(jù)儲存和版本可追溯性等。此外，標準品應用應貫穿在NGS檢測整個流程。
三、NGS技術臨床應用數(shù)據(jù)分析要點和報告內容及格式要求
NGS實驗室對變異結果描述及報告需遵循專業(yè)組織建議與指導。建議遵循人類基因組變異協(xié)會命名指南和美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會遺傳疾病變異分類指導。為避免結果混淆，在撰寫臨床結果報告時，需要詳細列出每個變異位點對應的轉錄本版本號及蛋白編號[12，14]。在描述疑似致病性變異時，需充分考慮疾病表型、不同人群發(fā)病率、外顯率及功能學實驗，并需要充分利用一些公共數(shù)據(jù)庫。對于一些外顯子組或基因組檢測來說，評估一個基因對疾病影響程度，了解不同變異類型對疾病貢獻度及這些變異遺傳模式至關重要[12，15]。報告內容和格式要求可參考中國醫(yī)師協(xié)會檢驗醫(yī)師分會發(fā)布的《臨床基因檢驗診斷報告模式專家共識》、美國分子病理學會、美國臨床腫瘤學會和美國病理學會專家共識。以及歐盟NGS診斷指南[17]。NGS檢測報告清晰性和一致性至關重要，應準確客觀地描述所檢驗結果，避免引起歧義。內容總體應該明確簡潔并具有充分解釋。
四、我國NGS技術發(fā)展需要注意的幾個問題
當前國內NGS技術硬件和國外發(fā)展同步，但軟件建設滯后，硬件建設可以通過購買迅速完成，軟件建設需要長時間積累。軟件建設包括適合國內國情的規(guī)范的檢測指南，合理有效的監(jiān)管措施，完善數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)以及符合患者需求的遺傳咨詢體系等。此外，為保證臨床和檢測實驗室溝通順暢，需要積極提倡中文人類表型標準用語。隨著基因測序技術飛速發(fā)展，獲取基因數(shù)據(jù)越來越便捷，與之對應表型信息采集效率滯后。由于臨床醫(yī)學歷史悠久，疾病命名和分類復雜多樣;很多疾病存在臨床變異性，不同醫(yī)師對于患者描述也存在差異。模糊表型信息與基因數(shù)據(jù)連接存在障礙，給基因數(shù)據(jù)解讀帶來困難。
五、展望
隨著NGS技術不斷改進，高通量長讀長NGS將是大勢所趨，檢測對象將逐漸從DNA層面向RNA層面轉移。新一代NGS檢測靈敏度、準確性和操作便捷性將大大提高。我們有理由相信隨著檢測費用持續(xù)下降、測序方法優(yōu)化升級、數(shù)據(jù)解讀能力智能化以及臨床經(jīng)驗不斷積累，人員培訓、數(shù)據(jù)處理、質量控制、倫理等問題都將迎刃而解，NGS技術將會逐漸成為臨床主要且常規(guī)的檢測項目。